李兰娟团队：发现新冠病毒19个致病性新突变

总的来说，尽管在这项研究中只分析了11株来自病人的病毒株，研究人员仍观察到突变多样性，包括目前在全球传播的不同主要病毒簇的几种基本突变。这种多样性的突变谱与它们相对较早的采样时间和相对接近武汉市是一致的。不过，由于样本量有限，武汉地区早期病毒的完全变异多样性至今仍不清楚。

研究人员讨论指出，在11个病毒分离株中发现了多种突变，包括目前感染全球人口的两大类病毒的两组始祖突变。此外，尽管取样日期相对较早，31个已鉴定的突变中有19个是新的，这表明病毒株的真正多样性在很大程度上仍未得到充分认识。

另外，T22303G突变在5个病毒株中均观察到，这个特定的突变在早期疫情中已经出现，并可能在相当数量的武汉人身上都有。这可能是由于突变的始祖效应，在这种效应情况下，T22303G突变在早期并没有从中国传播出去。

值得注意的是，ZJU-11的三核苷酸突变是出人意料的。研究人员注意到，这个特殊的病毒分离株在研究中的病毒载量和CPE测定中都显得非常“强有力”，其来源病人也非常罕见地持续45天新冠阳性，最近从医院出院。

他们认为，研究这种三核苷酸突变的功能影响将是非常有趣的。值得注意的是，在目前的数据库中，另一个三核苷酸突变（G28881A, G2882A和G28883C）已被鉴定出，也导致了两个蛋白水平的错义突变。

研究人员还提醒一点，与最近报道的不能从粪便样本中获得活病毒相反，这项研究中有3个病毒分离株是从粪便样本中提取的，研究表明新冠病毒能够在粪便样本中可以复制。

系统发育分析揭示不同的进化史

为了从已有的新冠病毒测序数据中了解11株病毒分离株的系统发育背景，研究人员从GISAID（下载于2020年3月21日）获得了725个高质量、高覆盖的新冠病毒基因组，其中包括2013年在云南中华菊头蝠中采集的RaTG13病毒株和广东穿山甲病毒株作为外群。

研究人员构建了一个包含736个病毒序列的最大似然系统发育树，得到的系统发育树与GISAID上更新的系统发育分析基本一致。

研究观察到相当多的始祖突变。具体来说，在这项系统发育分析中，研究人员注意到以下三个最大的簇：第一、在231个病毒序列中发现三个核苷酸突变C241T、C14408T和A23403G（S-D614G簇），大部分在欧洲分离获得；第二、在208个病毒序列中发现两个核苷酸突变C8782T和T28144C（ORF8-L84S簇），在这项分析中它们不是单源的(图2A和图S3)。然而，在ORF8-L84S簇内的92个基因组序列上可以观察到明显的单源亚支（subclade），主要由来自美国西雅图的病毒序列组成（ORF8-L84S-USA-WA-clade）；第三、在34个病毒序列中发现两个核苷酸突变G11083T (ORF1a中的L3606F)和G26144T (ORF3a中的G251V)，其中大部分来自荷兰和英国。

研究人员提到，还可以观察到几个由不同的始祖突变集定义的较小的单源簇。例如：第一、31个病毒序列发现了G1937A (ORF1a中的V378I)突变；第二、12个病毒序列中发现了G1440A和G2891A突变，导致了ORF1a基因的G392D和A876T突变，大部分来自德国或荷兰；第三、8个基因组序列中发现了C15325T和C29303T突变，导致了N基因的P344S突变，来自中国或日本。

研究人员将11株病毒分离株整合到系统发育分析中，它们分散在整个系统发育空间中。ZJU-1与ORF1a-L3606F和ORF3a-G251V组聚类，它同时具有这两种典型的突变。另一方面，ZJU-2与ZJU-8和ORF8-L84S聚类，它们都有两个始祖突变。由于上述T22303G突变，ZJU-9和ZJU-11与澳大利亚的一个分离株聚类。其他毒株则或者突变较少，或者没有与任何已知的大规模群体聚集的新突变，这反映了这11个样本的广泛多样性。

综上所述，研究人员认为，一些单源病毒群确实表现出明显的地理模式（特别是欧洲和美国），但这可能是由于在大流行初期发生各自突变的“始祖效应”。

感染Vero-E6细胞时，病毒拷贝数和细胞病理效应有显著差异

目前来看， COVID-19患者表现出多种临床症状，流行病学研究表明，临床结果受个体年龄、并发症和其他潜在未知参数的严重影响。为了检测患者来源的新冠病毒分离株的突变影响，研究人员进行了体外感染试验。

研究人员首先检测了病毒分离株是否能如预期那样成功地与Vero-E6细胞结合，并以S蛋白形成的标志性“皇冠”来直观识别病毒颗粒。然后，他们用所有11个病人来源的病毒分离株感染Vero-E6细胞，并在感染后1、2、4、8、24和48小时收集细胞。在48小时和72小时时分别取细胞的DIC显微照片来评估CPE。

他们使用针对ORF1a、E和N基因的特异性实时转录聚合酶链反应(RT-PCR)来检测新冠病毒的存在。循环阈值Ct用于量化病毒载量，较低的值表示较高的病毒载量。由于这三个基因的结果高度一致，他们只讨论ORF1a基因的结果。

简要来说，所有病毒分离株样本感染后1、2、4小时的Ct值保持平稳，仅有小的波动。在这些较早的时间点上，病毒粒子结合入侵细胞，病毒复制在这个阶段很少发生。

在感染后8小时，研究人员观察到ZJU-6、ZJU-7、ZJU-9、ZJU-10和ZJU-11的Ct值显著下降，即意味着病毒载量增加。感染后24小时，观察到除了ZJU-2和ZJU-7外，所有病毒分离株的Ct值都显著下降，其中一些病毒分离株，即ZJU-10和ZJU-11，下降速度比其他病毒快得多。感染后48小时，除ZJU-10和ZJU-11外，所有病毒分离株均有小幅度下降，研究人员推测ZJU-10和ZJU-11在24小时时均已趋于稳定。

（编辑：187手机网）

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